Entenda os princípios da citometria de fluxo por fluorescência e explore suas aplicações, além das soluções desenvolvidas pela Sysmex.

A capacidade de analisar milhares de células ou partículas individualmente em poucos minutos transformou a citometria de fluxo por fluorescência em uma das tecnologias mais importantes para laboratórios de pesquisa, microbiologia, biotecnologia, agrociências, aquicultura e melhoramento genético. Ao combinar sistemas ópticos, lasers e moléculas fluorescentes, essa técnica fornece informações multiparamétricas sobre características físicas e moleculares das amostras, permitindo análises rápidas, sensíveis e reprodutíveis. 

Com mais de cinco décadas de inovação em tecnologias para diagnóstico e pesquisa, a Sysmex é uma empresa japonesa, referência no desenvolvimento de soluções baseadas em citometria de fluxo. Seus equipamentos são projetados para otimizar rotinas laboratoriais, aumentar a eficiência analítica e fornecer resultados padronizados para aplicações que vão desde o controle microbiológico de processos industriais até a determinação de ploidia e tamanho do genoma em plantas e animais. 

Com a parceria com a Sysmex, a Tecnal, representante exclusiva da marca no Brasil, integra ao seu portfólio tecnologias consolidadas internacionalmente em citometria de fluxo por fluorescência. Essas soluções atendem laboratórios que buscam alto desempenho em caracterização celular, análises microbiológicas e estudos genéticos, ampliando o acesso a equipamentos especializados e metodologias consolidadas internacionalmente.

O que é citometria de fluxo? 

O nome já diz bastante, "cito" vem de célula, "metria" de medida e "fluxo" remete ao movimento contínuo das amostras durante a análise. Na prática, a citometria de fluxo é uma técnica que mede características físicas e moleculares de células ou partículas enquanto elas passam, uma a uma, por um feixe de laser dentro de um fluxo líquido contínuo. 

O que diferencia essa abordagem de métodos convencionais é justamente a análise individual. Em vez de avaliar uma população celular como um todo, o citômetro de fluxo examina cada célula separadamente, o que permite identificar subpopulações, detectar variações sutis e obter dados quantitativos com maior resolução.

Como funciona um citômetro de fluxo? 

Um citômetro de fluxo é composto por três subsistemas principais que trabalham em conjunto: fluídico, óptico e eletrônico. 

1. Subsistema fluídico: organizando o fluxo 

A amostra é introduzida no equipamento e conduzida por um sistema fluídico que organiza as células em uma fileira única, processo chamado de focalização hidrodinâmica ou foco hidrodinâmico. Isso garante que cada célula atravesse individualmente o ponto de leitura, chamado de ponto de interrogação, onde encontra o feixe de laser.

Figura 01. As partículas coradas são então injetadas na célula de fluxo, onde o foco hidrodinâmico garante sua separação para permitir contagens precisas de partículas.

2. Subsistema óptico: excitação e coleta da luz 

Ao passar pelo laser, cada célula interage com a luz de duas formas:

• Dispersão da luz: a luz é dispersada em diferentes direções. A luz frontal (FSC - forward scatter) está relacionada ao tamanho da célula, a luz lateral (SSC - side scatter) indica sua complexidade interna ou granularidade.
• Emissão de fluorescência: moléculas fluorescentes presentes na amostra absorvem energia do laser e emitem luz em comprimentos de onda característicos, que são captados por detectores específicos.

Os lasers são escolhidos por produzirem luz de alta intensidade e comprimento de onda preciso (monocromática), o que é essencial para excitar seletivamente os fluorócromos e obter sinais confiáveis. O laser azul de 488 nm é o mais comum, mas outros comprimentos de onda, como UV (365 nm) e verde (532 nm), são utilizados para aplicações específicas, especialmente quando o fluorocromo de escolha exige uma excitação diferente.

3. Subsistema eletrônico: convertendo luz em dados 

Os detectores convertem os sinais ópticos em corrente elétrica proporcional à intensidade da luz recebida. Esse sinal é amplificado, digitalizado e enviado ao software, que gera histogramas, gráficos de dispersão e dados quantitativos sobre cada célula analisada. Cada passagem de célula pelo laser gera um "evento", e o conjunto de todos os eventos forma os gráficos de citometria.

Figura 02. Citometria de fluxo por fluorescência. Um raio laser é direcionado para a célula de fluxo, atingindo todas as partículas que passam. A luz de fluorescência é emitida a partir de elétrons excitados dos corantes fluorescentes e, dependendo do tipo de partícula individual, a luz do laser que se aproxima é caracteristicamente desviada. Os fotodetectores reconhecem individualmente as partículas e, com base nos padrões de sinal individuais, os sinais são plotados em um diagrama de dispersão.

Por que a fluorescência é tão importante nessa técnica? 

A dispersão da luz informa sobre as características físicas da célula: tamanho e complexidade. Mas é a fluorescência que permite ir além, identificar e quantificar moléculas específicas presentes dentro ou na superfície das células. 

Isso é feito por meio de fluorocromos, moléculas que absorvem energia em um determinado comprimento de onda e a emitem em outro, sempre em comprimento de onda maior (e, portanto, menor energia). Na prática, esses fluorocromos são conjugados a anticorpos ou ligados diretamente a estruturas celulares como DNA, proteínas ou receptores de membrana. 

Como cada fluorocromo tem um perfil de excitação e emissão próprio, o equipamento consegue distinguir múltiplos sinais simultaneamente, tornando a análise verdadeiramente multiparamétrica.

Os equipamentos da Sysmex disponíveis na Tecnal 

A Sysmex é uma empresa japonesa com mais de cinco décadas de atuação em tecnologias para diagnóstico e pesquisa. Seus citômetros de fluxo são projetados com foco em aplicações específicas. Com a parceria entre Sysmex e Tecnal, esses equipamentos passaram a integrar o portfólio da Tecnal, ampliando o acesso a soluções especializadas.

CyFlow Cube 6 V2m: para aplicações microbiológicas 

O Cube 6 V2m é um citômetro de bancada compacto, pré-configurado para análises microbiológicas de rotina. Ele conta com um laser azul de 488 nm e cinco parâmetros de detecção (FSC, SSC e três canais de fluorescência), cobrindo bem as necessidades de quem trabalha com controle microbiano, fermentação e análise de partículas. 

Um dos seus diferenciais é a tecnologia TVAC (True Volumetric Absolute Counting), que realiza a contagem absoluta de partículas e células sem necessidade de microesferas de referência. Isso simplifica o protocolo e reduz variáveis no processo. O software CyView integrado facilita a aquisição e análise de dados em tempo real, e há opção de autocarregamento (autoloader) para processamento automatizado de até 96 amostras. 

Em comparação com o plaqueamento tradicional, o Cube 6 V2m pode reduzir o tempo de processamento em até 99%, resultados em minutos, com menor custo operacional.

CyFlow Ploidy: para análise de ploidia e tamanho do genoma 

O Ploidy V3 é uma solução dedicada à determinação de ploidia e tamanho do genoma em plantas e animais. Ele analisa núcleos marcados com fluorocromos específicos para DNA e gera histogramas de alta resolução, permitindo identificar diferenças no conteúdo genético com grande precisão. 

O equipamento está disponível em três versões, conforme o fluorocromo utilizado:

• DAPI (excitado por LED UV de 365 nm): solução rápida e econômica, ideal para análise de ploidia e detecção de aneuploidias.
• Iodeto de propídio — PI (excitado por laser verde de 532 nm): preferido quando o objetivo é a determinação do tamanho do genoma com alta exatidão, pois produz coeficientes de variação menores.
• DAPI + PI (combinação dos dois): para laboratórios que precisam da flexibilidade de trabalhar com ambas as abordagens. 

A análise é concluída em menos de dois minutos, com reagentes prontos para uso e protocolos validados. Para maior produtividade, há compatibilidade com a estação de autocarregamento CyFlow Space, que aceita até 96 amostras por vez.

Principais aplicações 

A versatilidade da citometria de fluxo faz com que ela esteja presente em contextos bastante distintos: 

• Pesquisa científica: universidades, institutos de pesquisa e centros de desenvolvimento utilizam a citometria de fluxo para caracterização celular, estudos populacionais e investigação de processos biológicos. A possibilidade de analisar múltiplos parâmetros simultaneamente permite gerar dados confiáveis para pesquisas em biologia, genética, ecologia, fisiologia e diversas outras áreas do conhecimento. 

• Microbiologia e controle de processos: na microbiologia, a citometria de fluxo possibilita análises rápidas de células e partículas, reduzindo significativamente o tempo necessário para obtenção de resultados quando comparada a métodos convencionais. 

           A tecnologia é utilizada para determinação da concentração celular, monitoramento de culturas microbianas, controle de fermentação, avaliação de partículas e acompanhamento de processos biotecnológicos, fornecendo informações importantes para laboratórios de pesquisa e para o controle de qualidade industrial. 

• Agrociências e melhoramento genético: determinação do nível de ploidia e do tamanho do genoma em plantas. Essas informações são fundamentais em programas de melhoramento genético, desenvolvimento de novas cultivares, produção de sementes, identificação de híbridos, estudos de poliploidia e caracterização de espécies vegetais. A rapidez e a precisão da técnica permitem substituir procedimentos tradicionais mais demorados, tornando o fluxo de trabalho mais eficiente e padronizado. 

• Aquicultura e taxonomia: a determinação do tamanho do genoma e dos níveis de ploidia também desempenha um papel importante em estudos envolvendo organismos aquáticos, evolução das espécies e classificação biológica. 

           Por meio da análise de núcleos marcados com fluorocromos específicos, pesquisadores podem caracterizar populações, investigar estruturas genéticas e acompanhar programas de reprodução, contribuindo para pesquisas em biodiversidade, ecologia e desenvolvimento de organismos de interesse econômico.

Citometria de fluxo: eficiência analítica para diferentes aplicações 

A citometria de fluxo por fluorescência se destaca como uma tecnologia essencial para laboratórios que demandam análises rápidas, precisas e com alto volume de dados. A combinação entre sistemas ópticos avançados, fluorocromos específicos e processamento digital permite obter, em poucos minutos, informações que métodos convencionais levariam muito mais tempo para gerar, com um nível de detalhe significativamente superior. 

Os equipamentos da Sysmex seguem essa abordagem, aliando tecnologia avançada a aplicações práticas, com fluxos de trabalho otimizados para as necessidades reais dos laboratórios. 

Para saber mais sobre os equipamentos CyFlow Cube 6 V2m e CyFlow Ploidy, entre em contato com a Tecnal.

Referências 

COSTA, Rodrigo Netto. Introdução à Citometria de Fluxo: Um manual básico para iniciantes. 2020. 

DOS SANTOS, A. et al. Citometria de Fluxo: Fundamentos e Aplicações na Pesquisa Científica. Rio de Janeiro. 2017.